條鏈 cDNA合成試劑盒由專業(yè)試劑供應(yīng)商北京百奧萊博提供，僅用于生物化學(xué)研究方面，我公司的條鏈 cDNA合成試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過(guò)多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購(gòu)。...

特別提示：包括條鏈 cDNA合成試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：條鏈 cDNA合成試劑盒
英文名稱：First Strand cDNA Synthesis Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：SY0290
產(chǎn)品規(guī)格：50T

本試劑盒是基于Reverse Transcriptase，該酶熱穩(wěn)定性提高，在50℃的半衰期超過(guò)240min，且可長(zhǎng)時(shí)間耐受高達(dá)55℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄，能穩(wěn)定可靠地合成cDNA。且Reverse Transcriptase的獨(dú)特設(shè)計(jì)，進(jìn)一步增強(qiáng)了模板親和力和行進(jìn)性，使得全長(zhǎng)cDNA的合成能力有了大幅度提升，可獲得長(zhǎng)達(dá)20 kb的cDNA，并且對(duì)于常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄抑制物具有更高的耐受度，非常適合于植物組織RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

本試劑盒包含由總RNA或mRNA合成高質(zhì)量條鏈cDNA所需的所有成分，并提供兩種cDNA合成引物：Random hexamers和oligo（dT）18。合成的單鏈cDNA產(chǎn)物可直接用來(lái)進(jìn)行后續(xù)PCR、qPCR以及PCR克隆。其中，5×RT Mix包含優(yōu)化的緩沖體系和dNTP； Enzyme Mix包含Reverse Transcriptase和RNase inhibitor?？筛鶕?jù)需要，選擇Oligo (dT)18、Random hexamers或基因特異引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物。

試劑盒組分：

組份	規(guī)格
RNase free ddH2O	1 ml
5×RT Mix	200 μl
Enzyme Mix*	50 μl
Oligo dT18 (0.5 μg/μl)	50 μl
Random hexamers (N6)	50 μl
*包含RNase inhibitor，用于抵抗環(huán)境和體系中可能存在的痕量的RNase。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期一年。

質(zhì)量控制

所有組分經(jīng)檢測(cè)均無(wú)核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、RNase殘留。
功能檢測(cè)1：以500 ng mouse total RNA為模板，Oligo dT18為引物，50℃反應(yīng)45分鐘。取1/10 cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增nebulin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見(jiàn)有單一的20.0 kb條帶。
功能檢測(cè)2：以100 pg Hela cell total RNA為模板，Oligo dT18為引物，50℃反應(yīng)30分鐘。取1/10 cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增β-actin基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見(jiàn)有單一的550 bp條帶。
功能檢測(cè)3：以500 ng Hela cell total RNA為模板，Oligo dT18為引物，55℃反應(yīng)45分鐘。取1/10 cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Polε基因。瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，可見(jiàn)有單一的4.8 kb (GC-rich)條帶。
功能檢測(cè)4：以1 pg-1 μg HeLa cell total RNA為模板，以O(shè)ligo dT18和Random hexamers為引物，測(cè)試qRT-PCR性能。

以6個(gè)數(shù)量級(jí)的模板量的對(duì)數(shù)值對(duì)Ct值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2>0.990，斜率在-3.20到-3.60之間。

客戶需要準(zhǔn)備的材料
1.RNase free的1.5 ml微量離心管或0.2ml PCR管
2.水浴鍋或PCR儀
3.冰
4.RNA（高質(zhì)量的完整的RNA對(duì)于獲得高質(zhì)量的cDNA是至關(guān)重要的。

引物選擇
1） 如果模板為真核生物來(lái)源，建議選擇Oligo dT18，其與真核生物mRNA的3’Poly A尾配對(duì)，可獲得zuì高產(chǎn)量的全長(zhǎng)cDNA。
2）基因特異性引物 (GSP)的特異性zuì高。但有些情況下，用于PCR反應(yīng)的GSP無(wú)法有效引導(dǎo)鏈cDNA合成。這時(shí)，可改用Oligo dT18或Random hexamers重新進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
3）Random hexamers特異性zuì低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可以作為Random hexamers的模板。當(dāng)目標(biāo)區(qū)域具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或GC含量較高，或者模板為原核生物來(lái)源，使用Oligo dT18或基因特異性引物 (GSP)無(wú)法有效引導(dǎo)cDNA合成時(shí)，可使用Random hexamers為引物。

應(yīng)用實(shí)例

1 條鏈cDNA合成*（以20μl反應(yīng)體系為例）
1）按照下表在RNase free離心管中配制如下混合液：

RNase free ddH2O	to 20 μl
Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)	1 μl
or Random Primer	or 1 μl
or Gene Speicific Primers	or 2 pmol
5×RT Reaction Mix	4 μl
Enzyme Mix**	0.8-1μl
模板RNA	Total RNA: 50 ng-5 μg/mRNA: 5-500 ng

*可選步驟（一般不需要）：如果RNA模板GC含量豐富或者有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以先只加RNA模板、引物和和RNase free H2O混勻，65℃變性5分鐘，冰上冷卻 5min，短暫離心后加入其它成分繼續(xù)下面的反轉(zhuǎn)錄步驟。
** Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸頭外導(dǎo)致?lián)p失，用前請(qǐng)瞬時(shí)離心后使用，并且避免吸頭外壁沾附損失?？擅看伟凑?.8μl使用，不會(huì)影響使用效果。

2）用移液槍輕輕吹打混勻。
3）如用Oligo(dT)18或基因特異引物(GSP)，42℃孵育30-50min。
如用Random Primer，25℃孵育10 min，42℃孵育30-50 min。
4）65℃加熱15 min(或者85℃加熱5 min)失活Reverse Transcriptase。

2 RT-PCR
建議取1/10-1/5 體積(2-4 μl)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板。
1）建議反應(yīng)條件

Components	Volume	Final Concentration
cDNA Template	2 μl	as required
Forward Primer (10 μM)	1 μl	0.2 μM each
Reverse Primer (10 μM)	1 μl	0.2 μM each
10×Taq Buffer (含Mg2+)	5 μl	1×
2.5 mM dNTPs	4 μl	0.2 mM
Taq DNA Polymerase	0.5 μl	2.5 units
ddH2O to final volume	50 μl	Not applicable

注意事項(xiàng)
1）所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行。
2）除使用RNase free的槍頭和離心管外，RNA實(shí)驗(yàn)用的試劑建議專用，并在單獨(dú)的潔凈的區(qū)域操作。操作時(shí)，戴上口罩和一次性手套，避免說(shuō)話。總RNA提取完成后，建議取少量跑1%瓊脂糖凝膠電泳，檢驗(yàn)RNA的完整性。
3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)抑制物包括酚，鹽，SDS，EDTA等。建議用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔細(xì)洗滌RNA沉淀 (輕彈管底讓沉淀懸浮，并靜置數(shù)分鐘)。
4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。





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貨號(hào)	名稱	規(guī)格
BTN60804	PCR抑制物清除劑	1mL
BTN130833	LAMP可見(jiàn)光染料	1mL
YT381	PCR試劑盒(含YT Taq酶，Buffer，dNTP，上樣液)	400次
YT395	cDNA鏈合成試劑盒(RNase H-)	10次
YT397	cDNA鏈合成試劑盒II(RNase H-)	20次|100次
WE0105	BAmp DNA Polymerase	500U

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ALH190 miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒 50μl×50次
RFT091 2×GC Buffer 1ml|5×1ml|10×1ml

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