零背景快速克隆試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科研試驗(yàn)，我公司專注于克隆與表達(dá)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和供應(yīng)，為您提供的零背景快速克隆試劑盒質(zhì)量可靠，批間差小，且價(jià)格公道，熱切盼望您選購(gòu)我們的產(chǎn)品。...

特別提示：包括零背景快速克隆試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：零背景快速克隆試劑盒
英文名稱：Zero-Background Fast Cloning Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：WH0191
產(chǎn)品規(guī)格：20次

本試劑盒是一種陽(yáng)性選擇克隆系統(tǒng)，可以克隆各種PCR產(chǎn)物和任何具有平末端或粘性末端的DNA片段。該試劑盒對(duì)磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。陽(yáng)性選擇載體和插入片段連接僅需5min即可獲得超過95%的陽(yáng)性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu Polymerase）擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物可直接連入克隆載體。由無校正活性的聚合酶（如：Taq Polymerase）或聚合酶混合物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在連接前需用試劑盒提供的熱穩(wěn)定DNA平端化酶進(jìn)行末端平端化（7 min）即可。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化常用的大腸桿菌菌株。

本試劑盒提供了一種即用型陽(yáng)性選擇克隆載體。該載體含有致死基因（內(nèi)含多克隆位點(diǎn)），多克隆位點(diǎn)插入外源片段會(huì)引起基因失活，因此只有轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的細(xì)菌才能存活形成克隆菌落。而自身環(huán)化的載體表達(dá)致死的毒性蛋白（無外源片段插入），轉(zhuǎn)化后殺死大腸桿菌細(xì)胞。這種陽(yáng)性篩選策略無需藍(lán)白斑篩選，大地加速了克隆篩選進(jìn)程。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
·快速：零背景無需藍(lán)白斑篩選，5min快速連接；
·靈敏廣泛：適合低濃度片段和長(zhǎng)片段連接，適合平/粘末端連接。

載體圖譜：



試劑盒組成：

組分	規(guī)格
Vector（35ng/μl)	20μl
T4 DNA Ligase （3U/μl)	20μl
2×Reaction Solution	100μl
Blunting Enzyme	10μl
Forward Sequencing Primer（10μM)	200μl
Reverse Sequencing Primer（10μM)	200μl
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	10μl
ddH2O	1ml

保存條件：-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
Forward Sequencing Primer，23-mer：5"-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3"
Reverse Sequencing Primer，24-mer：5"-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3"

不同片段使用量：
1．載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:10，對(duì)于1kb以下的片段建議使用1:3的比例，1kb以上的片段建議使用1:7的比例。
2．請(qǐng)根據(jù)凝膠電泳或紫外分光光度計(jì)檢測(cè)后的濃度和片段長(zhǎng)度來計(jì)算其摩爾比。插入片段用量，可根據(jù)以下公式粗略計(jì)算：
  插入片段用量ng=（3～10)×插入片段長(zhǎng)度/載體長(zhǎng)度×載體用量ng
  連接體系中35ng的載體，不同大小的PCR產(chǎn)物zuì佳加入量舉例如下：

PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度	zuì佳的使用量
700bp	25ng
2000bp	165ng

注意事項(xiàng)：請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)。
1．轉(zhuǎn)化過程中使用對(duì)照片段做對(duì)照是非常必要的，在實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題時(shí)可以確定原因。
2．建議留下部分連接產(chǎn)物，在出現(xiàn)問題后能迅速的補(bǔ)救，減少不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
3．涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)作相應(yīng)調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過離心（4000rpm，2 min）后吸除部分培養(yǎng)液，留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）。

使用方法（以下的步驟請(qǐng)?jiān)跓o菌條件下操作）
一、平末端連接方法：
  ?用于高保真耐熱DNA聚合酶產(chǎn)生的具有平末端的PCR產(chǎn)物的克隆。
  ?若由其他耐熱聚合酶產(chǎn)生的粘性末端的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆時(shí)，請(qǐng)行平端化，詳見“粘末端連接方法”。
  ?本方法也適用于由限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的平末端的DNA片段，連接前DNA片段應(yīng)使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，載體與片段的摩爾比參考“不同片段使用量”的介紹。
1．按照下表的內(nèi)容在無菌的離心管中加入各種成分

成分	使用量
目的PCR片段	X μl
Vector（35ng/μl）	1 μl
2×Reaction Solution	5 μl
T4 DNA Ligase（3U/μl）	1 μl
ddH2O	補(bǔ)足至10 μl

  輕彈離心管以混勻反應(yīng)液，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應(yīng)液放置室溫（22℃）反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上，進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
  注意：如果插入片段長(zhǎng)度大于3 kb，可以將反應(yīng)時(shí)間zuì大延長(zhǎng)至30 min。

二、粘性末端連接方法：
  用于Taq DNA Polymerase或含有Taq DNA Polymerase的混合酶產(chǎn)生的3′端帶A的PCR產(chǎn)物的克隆。
  如果PCR產(chǎn)物末端的結(jié)構(gòu)不明確，請(qǐng)使用粘性末端連接方法。
  本方法也適用于由限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的5"或3"帶有突出端的DNA片段，連接前DNA片段應(yīng)使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，載體與片段的摩爾比參考“不同片段使用量”的介紹。
1．按照下表的內(nèi)容在無菌的離心管中加入各種成分，進(jìn)行平端化反應(yīng)。

成分	使用量
Insert DNA	X μl
2×Reaction Solution	5 μl
Blunting Enzyme	0.5 μl
ddH2O	補(bǔ)足至8 μl

  輕彈離心管以混勻反應(yīng)液，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應(yīng)液置于20℃反應(yīng)2 min，然后置于70℃反應(yīng)5min，放在冰上短暫冷卻。
3．向平端化的反應(yīng)體系中加入下列成分

成分	使用量
Vector（35ng/μl)	1 μl
T4 DNA Ligase （3U/μl)	1 μl

4．將混合反應(yīng)液置于室溫（22℃）反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上，進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
  注意：如果插入片段長(zhǎng)度大于3 kb，可以將反應(yīng)時(shí)間zuì大延長(zhǎng)至30 min。

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：（實(shí)驗(yàn)方法同粘性末端連接）
1．按照下表的內(nèi)容在無菌的離心管中加入各種成分，進(jìn)行平端化反應(yīng)。

成分	使用量
Control Insert DNA（700bp,50ng/μl)	0.5μl
2×Reaction Solution	5μl
Blunting Enzyme	0.5μl
ddH2O	補(bǔ)足至8μl

  輕輕彈動(dòng)離心管以混勻內(nèi)容物，短暫離心3-5 sec。
2．將混合反應(yīng)液置于20℃反應(yīng)2 min，然后置于70℃反應(yīng)5min，放在冰上短暫冷卻。
3．向平端化的反應(yīng)體系中加入下列成分

成分	使用量
Vector（35ng/μl)	1 μl
T4 DNA Ligase （3U/μl)	1 μl

  輕彈離心管以混勻反應(yīng)液，短暫離心3-5 sec。
4．將混合反應(yīng)液置于室溫（22℃）反應(yīng)5min。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上，進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

轉(zhuǎn)化
1．制備含有氨芐青霉素終濃度100μg/ml的LB瓊脂糖平板。將平板放置在37℃，至少預(yù)熱20min。
2．轉(zhuǎn)化
a．取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μl 0感受態(tài)細(xì)胞中（感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30 min（必要時(shí)請(qǐng)使用超螺旋質(zhì)粒pUC19同步轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞作為對(duì)照檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率，將0.1 ng pUC19加入另一只感受態(tài)細(xì)胞管中，其余的操作步驟與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟同步進(jìn)行）。
b．將離心管置于42℃恒溫90 sec，取出管后立即置于冰浴中放置2-3 min，其間不要搖動(dòng)離心管。
c．向離心管中加入250-500 μl 37℃預(yù)熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，150 rpm、37℃振蕩培養(yǎng)45min。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。
d．將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16h。

檢測(cè)
1．常規(guī)檢測(cè)：將得到的菌落接種1-5ml LB培養(yǎng)基（含有終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素）培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
  Control Insert DNA的PCR鑒定，請(qǐng)參考以下反應(yīng)條件：

2．快速檢測(cè)：挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)（具體方法見分子克隆第三版）。
3．測(cè)序鑒定：使用常規(guī)或快速方法進(jìn)行初步的鑒定后進(jìn)行序列的測(cè)定。

反應(yīng)體系：
標(biāo)準(zhǔn)體系為10μl體積，5μl的反應(yīng)體系也能取得很好的效果，試劑用量減半。

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名稱：即用型藍(lán)白T載體E型(無RNA啟動(dòng)子，無MCS)
貨號(hào)：BTN120515
規(guī)格：20次
本產(chǎn)品是用Xcm I酶切線性化的DNA片段，其兩個(gè)末端的5′都有一個(gè)突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐熱酶(如Taq DNA聚合酶)擴(kuò)增得到的PCR片段。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 由于是通過酶切制備，所以載體兩端的帶T率為，遠(yuǎn)高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端轉(zhuǎn)移酶在平末端載體加尾得到的T載體。
2. 克隆的陽(yáng)性率一般在90%以上，縮短了篩選過程。
3. 來源于pUC19 ，無RNA聚合酶啟動(dòng)子，插入位點(diǎn)兩側(cè)無多克隆位點(diǎn)。
4.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測(cè)序引物測(cè)定插入片段的序列。
5. T克隆位點(diǎn)位于β-半乳糖苷酶的α 肽編碼區(qū)內(nèi)，可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。
6.含有絲狀噬菌體f1 復(fù)制起始子，可以制備單鏈DNA。

產(chǎn)品組成：

組分	規(guī)格
即用型藍(lán)白T載體E型(10ng/μL)	60μl
陽(yáng)性對(duì)照(35ng/μl)	30μl

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期兩年。

質(zhì)粒圖譜


名稱：cl857 Sam7 λDNA(非甲基化)
貨號(hào)：BTN90407C
規(guī)格：5μg
本產(chǎn)品Lambda DNA(λDNA)為λ噬菌體中的DNA，是一種常見的DNA底物，分子量為31.5×106Da/48502bp，濃度為200～500μg/ml。A型為普通Lambda DNA。B型為不含N6-甲基腺嘌呤Lambda DNA。C型為非甲基化的cl857 Sam7 λDNA，是從感染的大腸桿菌GM119菌株中分離得到的。該菌株缺乏dam及dcm甲基化酶活性。非甲基化的λDNA以作為對(duì)DNA甲基化敏感的限制性酶的底物。

儲(chǔ)存溶液：Tris-HCl(pH8.0)10mM；EDTA 1mM

儲(chǔ)存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。

純度：
1. OD260nm/280nm＞1.8。
2. 瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)清晰單一條帶。
3. 1μg的λDNA在Hind III酶切Buffer中37℃保溫16小時(shí)后，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)清晰單一條帶。
4. 1g的λDNA 用Hind III酶切(37℃，2小時(shí))后，在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)出現(xiàn)8條清晰的DNA電泳帶。

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