DNA探針變性液由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品僅用于生物化學(xué)研究方面，我公司的DNA探針變性液品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括DNA探針變性液在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：DNA探針變性液
英文名稱：DNA Probe Denaturation Solution
產(chǎn)品貨號：BTN131208
產(chǎn)品規(guī)格：10mL

雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交(包括檢測RNA時(shí))，雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。本產(chǎn)品就是即用型的DNA探針變性液，專門針對DNA探針在雜交前進(jìn)行變性處理。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 即開即用。
2. 使用方便快捷，可用于核酸雜交。

儲存條件：低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、根據(jù)探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計(jì)算雜交分子的Tm 值
1. 對 DNA-DNA雜交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
說明：L是探針或靶分子的長度(用兩者中zuì短的一個(gè))
 GC%是探針或靶分子中的GC 百分比(用兩者中zuì短的一個(gè))
 Na+濃度是超級雜交液中Na+的濃度，為0.75 M，16.6×log10[Na+]=(-2.07)
2. 對 DNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 對 RNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 對 Oligo探針雜交，Tm=GC 數(shù)量×4℃+AT 數(shù)量×2℃。

二、確定zuì佳雜交溫度(預(yù)雜交溫度跟雜交溫度應(yīng)該一樣)
1. 對于大于200bp的DNA-DNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃，一般選擇68℃。
2. 對 RNA-RNA或DNA-RNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃。
 如果這樣計(jì)算出的雜交溫度很高(如高于70℃)，則RNA 容易降解，所以zuì好選用含甲酰胺的超級雜交液(超級雜交液B型)，以便能在42℃完成雜交。
3. 對 Oligo探針的雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低5℃。由于Oligo 較短，更容易受各種因素影響(如錯(cuò)配率、修飾堿基比例等)，所以zuì佳溫度需要適度摸索和優(yōu)化。

三、確定洗膜溫度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此條件下的zuì佳洗膜溫度比Tm低5-12℃，一般情況下可以在55℃進(jìn)行洗膜。Oligo探針可以室溫洗膜。

四、預(yù)雜交步驟
 預(yù)雜交就是用不含探針的超級雜交液跟印跡膜進(jìn)行孵育，其目的是用所含的非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點(diǎn)封閉，否則這些位點(diǎn)會吸附標(biāo)記的探針，造成高背景。
1. 將結(jié)合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的6×SSC溶液中，使其充分濕潤。
2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中(塑料袋zuì好預(yù)先封口，再剪掉一角，留一個(gè)小口)，按每平方厘米印跡膜加0.2mL超級雜交液的比例沿小口加入超級雜交液，然后用塑料封口機(jī)將口封牢。
3. 將此塑料袋浸沒入溫度設(shè)定在zuì佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫1-2小時(shí)，延長到12-16小時(shí)亦可。注意保溫過程中塑料袋應(yīng)在不停的搖動狀態(tài)中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟
1. 如果標(biāo)記的探針是雙鏈核酸，則需經(jīng)變性處理。具體操作是：根據(jù)探針濃度和雜交所需探針的量計(jì)算出所需的探針體積，取出所需體積的探針到一干凈的硅化的塑料離心管中，加入等體積的本產(chǎn)品，吹打混勻后室溫放置5分鐘變性后，將探針樣品放入冰浴中冷卻，加入0.05倍體積的自備的1 M的Tris-Cl溶液(pH7.2)以及等體積的自備的0.4 M的HCl溶液。
將探針樣品保存在冰浴中直至需要。如果是單鏈DNA或RNA探針，則不需變性，直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預(yù)雜交的雜交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機(jī)封口)。探針的加入量視探針標(biāo)記效率而定，一般要求終濃度不能低于1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應(yīng)加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應(yīng)將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發(fā)生遺漏、污染工作環(huán)境。
3.在選定的雜交溫度下繼續(xù)保溫，時(shí)間一般為6-12小時(shí)。

六、洗膜步驟。
 注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。此步是將與印跡膜非特異結(jié)合的探針分子洗去而只留下特異結(jié)合的探針分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩(wěn)定性較差，在一定的溫度和較低的離子強(qiáng)度下，即可洗掉。
1.雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。
2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的2×SSC(含0.5 % SDS)溶液中，室溫下振蕩漂洗15分鐘。
3. 重復(fù)上步操作一次。
4. 將印跡膜轉(zhuǎn)移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在計(jì)算好的洗膜溫度下振蕩漂洗30分鐘至1小時(shí)。
5. 重復(fù)上步操作一次。如果是同位素標(biāo)記探針，則需要重復(fù)至用蓋革計(jì)數(shù)器在無核酸區(qū)域檢測不出放射信號為止。
6. 將印跡膜轉(zhuǎn)移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續(xù)檢測。

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BTN120653B 填入法DNA末端標(biāo)記試劑盒(生物素標(biāo)記dUTP) 5次
BTN100812 BLOTTO溶液 250mL
BTN91104A Denhardt溶液(同位素探針) 250mL
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BTN120643 硫酸葡聚糖 1g
BTN131117 DNA包被溶液 250mL

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名稱：PCR法DNA探針生物素標(biāo)記試劑盒
貨號：BTN90604B
規(guī)格：5次
PCR標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的dNTP進(jìn)行PCR，zuì后得到的PCR產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。其原理示意圖如下：


產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規(guī)PCR(用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對照反應(yīng))和5次50μl體系的標(biāo)記反應(yīng)。
3.一次標(biāo)記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標(biāo)記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和地gāo辛標(biāo)記的底物。自備的標(biāo)記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產(chǎn)品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個(gè)核苷酸中有4-5個(gè)將帶有非同位素標(biāo)記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規(guī)格
2×標(biāo)記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標(biāo)記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準(zhǔn)備工作
1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì)PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號強(qiáng)度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。
2. 根據(jù)PCR引物優(yōu)化PCR條件。
3. 由于標(biāo)記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復(fù)雜DNA為模板直接進(jìn)行PCR標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來提高成功率，即先制備非標(biāo)記PCR產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
二：非標(biāo)記PCR產(chǎn)物的制備
4. 設(shè)置50μL PCR的反應(yīng)體系：

成份	用量
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質(zhì)粒DNA
超純水	補(bǔ)到50μL

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR參數(shù)進(jìn)行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產(chǎn)物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產(chǎn)物(具體取決于PCR產(chǎn)物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記PCR。
三：標(biāo)記PCR反應(yīng)(zuì好做一個(gè)不加標(biāo)記的對照用于定量)
說明：在設(shè)置下面反應(yīng)時(shí)，如果加一種引物，就得到單鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會復(fù)性，這種復(fù)性會與探針-靶DNA雜交反應(yīng)相競爭，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標(biāo)記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標(biāo)記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標(biāo)記：探針引物一和引物二 單鏈標(biāo)記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產(chǎn)物 (單鏈標(biāo)記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補(bǔ)到50μL	補(bǔ)到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標(biāo)記底物與非標(biāo)記底物的比例已經(jīng)進(jìn)過優(yōu)化，如果自備標(biāo)記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優(yōu)化，標(biāo)記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到35-55個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的PCR產(chǎn)物，探針對擴(kuò)增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好)，所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加15秒，因?yàn)闃?biāo)記dUTP參入到DNA的速度比常規(guī)的dTTP慢；三是降低復(fù)性溫度5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)和對照反應(yīng)的產(chǎn)物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記反應(yīng)的PCR產(chǎn)物中額外帶有非同位素的配體(生物素，地gāo辛等)、因此其泳動速度將慢于非標(biāo)記PCR產(chǎn)物(但同位素標(biāo)記不能用此法)。
 注意：如果擴(kuò)增的是單鏈DNA探針，其結(jié)合EB的能力遠(yuǎn)低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區(qū)域折疊形成的有限雙鏈區(qū)，因此能結(jié)合的EB很少)，因此EB染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng)DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經(jīng)過單鏈PCR擴(kuò)增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時(shí)不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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