轉(zhuǎn)錄譜分析可以為組織和疾病的細(xì)胞狀態(tài)和表型提供寶貴的信息。這種方法特別適用于在例如藥物或疾病狀態(tài)等干擾情況下對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行研究，所得到的數(shù)據(jù)有助于推測(cè)感興趣的目標(biāo)通路、獨(dú)特的功能狀態(tài)、與疾病狀態(tài)的相關(guān)性以及新的亞型分類。

某些測(cè)序方法，例如Smart-Seq2，能夠利用從少量細(xì)胞(大約1-1000)中提取的RNA來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)錄組，因此能夠分析細(xì)胞數(shù)目低、細(xì)胞類型罕見(jiàn)或依賴于生物標(biāo)記材料的臨床樣本。許多研究已經(jīng)確定了低輸入或降解RNA樣本的jia處理程序和分析方法。全血防腐劑和穩(wěn)定劑的使用也使得利用少量血獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)成為可能。然而，將轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用到臨床樣本(如組織和已分類的細(xì)胞群)在樣本采集、樣本處理和組織分離方面遇到了獨(dú)特而重大的挑戰(zhàn)。例如，多中心研究常常需要對(duì)患者樣本進(jìn)行集中處理，這種轉(zhuǎn)移有引入偏倚的風(fēng)險(xiǎn)。此外，RNA質(zhì)量在組織之間可能存在很大差異，這或許會(huì)影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)于或難以處理的樣品而言，僅靠獲取足夠的高質(zhì)量樣品并不總能實(shí)現(xiàn)高RNA質(zhì)量目標(biāo)隊(duì)列的規(guī)模要求。

以往的研究很少關(guān)注RNA測(cè)序過(guò)程中由于樣本處理而引入轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的人為因素。對(duì)于微陣列或定量PCR產(chǎn)生的表達(dá)譜，已有研究發(fā)現(xiàn)一些能夠影響結(jié)果數(shù)據(jù)的因素。其中一項(xiàng)研究表明，標(biāo)準(zhǔn)白細(xì)胞采集程序之前的培養(yǎng)時(shí)間可以迅速改變血液的轉(zhuǎn)錄組。在4°C進(jìn)行運(yùn)輸可能會(huì)減輕這些變化，但無(wú)法完全消除影響。另一個(gè)研究利用微陣列技術(shù)探尋了時(shí)間、溫度和保存對(duì)分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)轉(zhuǎn)錄組的影響：每一種保存材料都對(duì)轉(zhuǎn)錄組有影響，但依賴于大量的血液。到目前為止，只有少數(shù)的研究闡明了通過(guò)白細(xì)胞分離方法和低輸入RNA測(cè)序所引入的人為影響因素。

在這篇文章中，研究人員描述了血液處理、白細(xì)胞分離方法和血液中分離得到的少量免疫細(xì)胞的保存方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組的整體影響。他們發(fā)現(xiàn)，在白細(xì)胞分離和分類之前，血液的儲(chǔ)存/運(yùn)輸溫度會(huì)導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞和單核細(xì)胞的整體變化，包括免疫相關(guān)基因的改變。通過(guò)使用白細(xì)胞過(guò)濾系統(tǒng)，這些變化可以被小化。研究人員使用這種方法從來(lái)自急性腦出血患者血液的免疫細(xì)胞中獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并與健康對(duì)照組相匹配。這些數(shù)據(jù)證明了這種過(guò)濾方法的實(shí)用性，并強(qiáng)調(diào)了在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析之前，必須使用明確的、緊密匹配的方法來(lái)處理樣本。

圖1. 樣品處理方法模式圖。本圖描述了臨床免疫學(xué)中用到的不同樣品處理方法，圖中包括血液運(yùn)輸溫度(20°C或4°C)，外周血單核細(xì)胞分離方法（Ficoll梯度、卡拉膠酶加Percoll梯度、全血溶解、白細(xì)胞過(guò)濾），以及所研究的不同類型的免疫細(xì)胞（CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、粒細(xì)胞或單核細(xì)胞）。

本研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在轉(zhuǎn)錄組研究中使用明確的可比較的方法十分必要，同時(shí)提出了一種能夠用于快速分離目的免疫細(xì)胞并使得轉(zhuǎn)錄組分析偏倚小化的過(guò)濾方法。