試劑盒的正確使用與否直接關(guān)乎著試驗(yàn)的成功與否，快來對(duì)照一下多重PCR擴(kuò)增試劑盒，你使用對(duì)了嗎!

所謂多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR），也稱復(fù)合PCR，由Chambehian' 在1988年提出（Chambehian' et.al.Nucleic Acids Res、1988 Dec 9; 16(23): 11141–11156.），基本原理與常規(guī)PCR相同，區(qū)別在于多重PCR的反應(yīng)體系是加入多對(duì)引物，各對(duì)引物分別結(jié)合在模板的相應(yīng)位置，zui終擴(kuò)增出多條DNA片段。

多重PCR實(shí)驗(yàn)流程

相比于液相雜交，多重PCR的是特異性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)周期短，技術(shù)也相對(duì)簡(jiǎn)單。下面為大家介紹實(shí)驗(yàn)流程：

我們公司多重PCR的實(shí)驗(yàn)，就是由兩輪PCR完成。di一輪PCR的作用是利用目標(biāo)區(qū)域特異的引物去擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物是目標(biāo)區(qū)域的富集片段，因此，此步驟也是實(shí)現(xiàn)了從基因組中“捕獲”目標(biāo)區(qū)域的目的。

之后把得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化，再通過第二輪PCR中引入Index和Adaptor。

這樣，在經(jīng)過了兩輪PCR后，就獲得了完整的文庫。把第二輪PCR產(chǎn)物純化后，就可以定量，測(cè)序了。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

1、先從樣本說起，我們公司的多重PCR平臺(tái)可以做的樣本包括血液，唾液，口腔拭子，在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于DNA投入量要求不是很高，根據(jù)不同項(xiàng)目需求，DNA投入量的范圍在100 pg到100 ng 之間。

2、進(jìn)行PCR反應(yīng)前，可以將所有 gDNA 的濃度稀釋到同一濃度，并轉(zhuǎn)移到 PCR 8 聯(lián)管中，一方面是便于排槍操作，另一方面是加入相同起始量的 gDNA，這樣可以降低zui終文庫的濃度差異，便于混合文庫。

3、大多數(shù)情況下引物是1管，操作相當(dāng)方便；當(dāng)目標(biāo)區(qū)域是外顯子或者是其他連續(xù)區(qū)域時(shí)，我們會(huì)把引物分裝為2管，分別命名Primer pool T1與Primer pool T2，這時(shí)需要第二輪PCR前把產(chǎn)物合并，再進(jìn)行下一步反應(yīng)。

4、執(zhí)行多重PCR反應(yīng)時(shí)，特別是樣本量多的情況下，可以將 T1 設(shè)為一組，T2 設(shè)為一組，便于制備反應(yīng)試劑混合液和排槍操作； 并把解凍好的試劑放置在冰盒上，在冰盒上進(jìn)行加樣操作。

5、在實(shí)驗(yàn)中，可以在PCR管壁上和管蓋上同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)編號(hào)標(biāo)記，防止高溫或其他原因?qū)е掠浱?hào)消失，避免后續(xù)產(chǎn)物混合操作失誤， 造成樣本交叉污染。

6、第二輪PCR后，因?yàn)?/span>YF Buffer B試劑比較粘稠，在清洗純化的時(shí)候不能吸走所有試劑，可以剩余5-10μl，否則會(huì)把磁珠一起吸走，造成樣品的損失，導(dǎo)致產(chǎn)物回收率下降。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后，正常文庫濃度處于5-30 ng/μl，而片段長(zhǎng)度一般在280-460 bp之間，且主峰前后無雜峰，就可以進(jìn)行測(cè)序了。

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