數(shù)字PCR是繼實時熒光定量PCR之后新興的一種核酸絕-對定量分析技能。經(jīng)過將含有樣本的數(shù)字PCR反響液渙散到不計其數(shù)個獨-立的微單元中，在PCR擴(kuò)增后對每個微單元中的熒光信號進(jìn)行判讀，計算出陰性和陽性的數(shù)量，蕞終利用泊松分布等統(tǒng)計學(xué)公式和軟件對結(jié)果進(jìn)行計算分析，然后完成靶標(biāo)分子的絕-對定量。 數(shù)字PCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，并且不受PCR擴(kuò)增效率影響，具有g(shù)eng高靈敏度和準(zhǔn)確度。

數(shù)字PCR的實際檢測過程中，卻發(fā)現(xiàn)許多情況下的準(zhǔn)確性未達(dá)到試驗的預(yù)期，到底哪些因素會影響其檢測成果的準(zhǔn)確性？



原始樣本濃度

在進(jìn)行數(shù)字PCR檢測之前，需確認(rèn)樣本的原始濃度，從而 防止由于樣本濃度過高出現(xiàn)所有微反應(yīng)單元全陽信號或濃度過低出現(xiàn)所有微反應(yīng)單元全陰信號，導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)公式計算誤差而形成檢測結(jié)果的不精-確。一般來講，樣本的原始濃度需在數(shù)字PCR的動力學(xué)檢測范圍內(nèi)(大多為5個數(shù)量級)， 理想情況下，當(dāng)陰性分區(qū)為總分區(qū)數(shù)的20.3%時，樣本濃度蕞佳。



樣本總體積

當(dāng)數(shù)字PCR總分區(qū)數(shù)一定時，樣本的總加載體積同樣會影響到蕞終的檢測準(zhǔn)確性。比如關(guān)于稀有靶標(biāo)的檢測，假設(shè)待測原始樣本每5ul中含有1個拷貝的靶標(biāo)分子，假如只取5ul參加反響，因為泊松散布的原理，這個靶標(biāo)分子很可能未被包含在5ul的原始樣本中。假如參加反響的樣本體積增加到15ul，就會大大提高待測樣本中該靶標(biāo)分子的檢測概率，然后提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和精-確性。



分區(qū)方法

數(shù)字PCR的分區(qū)方式主要為固相物理分割和 “油包水” 的液滴分區(qū)兩種。

然而，泊松分布計算準(zhǔn)確的前提是需要保證每個微反應(yīng)單元體積大小一致?！坝桶?液滴生成的過程中，每個液滴的體積大小無法保證完全相同。 液滴之間由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊?，?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少geng增加了交叉污染的風(fēng)險。

另外，還需注意微單元密閉與否。非密閉系統(tǒng)在PCR反響過程中，因為受熱會形成反響系統(tǒng)內(nèi)水分蒸發(fā)，然后形成反響系統(tǒng)體積變小，反響濃度隨之添加，同樣也會導(dǎo)致終究檢測結(jié)果的誤差。



樣本反應(yīng)液總有效分區(qū)數(shù)

所謂 有效分區(qū)數(shù),通俗來講是指蕞終生成含有反應(yīng)液的可被計算到蕞終統(tǒng)計學(xué)公式中的微反應(yīng)單元數(shù)。從剛才的介紹中我們已經(jīng)知道，不同的分區(qū)方式會影響到蕞終有效分區(qū)數(shù)。另外， 如何確定實際生成的有效分區(qū)數(shù)也很關(guān)鍵。泊松分布統(tǒng)計是根據(jù)有效分區(qū)數(shù)而非理論分區(qū)數(shù)來計算的。

操作誤差

微反應(yīng)單元制備的成功與否直接影響到蕞終數(shù)字PCR的結(jié)果。想要提高數(shù)字PCR結(jié)果的重復(fù)性及準(zhǔn)確性，就要盡可能避免操作誤差