細胞凍存、復蘇及細胞均勻鋪板技巧詳解

  細胞凍存：

  1. 實驗前準備：細胞室及工作臺紫外線照射15min;培養(yǎng)液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒溫水浴箱37℃預熱備用;收集對數(shù)生長期細胞，在凍存前一天換液

  2.用吸管吸出培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液，PBS清洗2遍吸出沖洗液，加入適量胰蛋白酶消化。

  3. 適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。吸管吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。

  4. 用吸管將培養(yǎng)液加入凍存管中，離心(1000r/min，10分鐘)。

  5. 去上清液，加入與細胞懸液等量的凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻

  6. 冷存管置于4℃10分鐘----20℃30分鐘----80℃16～18小時(或隔夜)---液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1h，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

  7.記錄每一個冷凍管的位置以確保在以后應用時能夠找到每一個冷凍管。

  細胞復蘇

  室內(nèi)紫外消毒;培養(yǎng)基、PBS于37℃恒溫水浴預熱備用。

  自液氮罐中取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，離心。

  去上清，加入培養(yǎng)基，吹打，然后移入培養(yǎng)瓶中，用培養(yǎng)基清洗凍存管，清洗液也移入培養(yǎng)瓶中。

  于培養(yǎng)瓶中加入適量培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

  記錄復蘇日期;次日換液。

  細胞均勻鋪板技巧：

  1、一般96孔板,每孔是加100微升細胞懸液，從孔的左邊靠近底部加入，加完半邊板后，將未加的細胞懸液混一下再，繼續(xù)加剩余的半邊板子，都加完后蓋上蓋子，左手輕輕扶住板的左邊，右手輕輕敲擊板的右邊緣，注意把握力度，太強或次數(shù)太多會導致細胞集中成堆，將板順時針旋轉(zhuǎn)(逆時針效果不好)，依次敲擊剩余三個邊，靜置約5分鐘，放入37度培養(yǎng)箱。

  6孔板12孔板或24孔板，均采用將個孔加入少量無血清培養(yǎng)基，晃動浸潤整個孔底，然后用移液槍吸至第二孔，同樣方法浸潤孔底，其它孔一次類推，這樣整個孔底都是濕潤的，細胞懸液會平鋪在整個孔底，加細胞懸液的時候可以避免加在中間中間細胞多，而加在周邊晃勻后周邊細胞多中間少的現(xiàn)象，細胞分散較均勻，注意加完細胞懸液后要放工作臺靜置一下。

  2、細胞懸液加完后，將細胞培養(yǎng)板抬高，對著燈光，從底部往上看，看細胞有沒有抱團。然后從底部敲擊，使之分散。

  3、如果實驗室有平板振蕩器的話，建議用這個儀器稍振蕩一下，效果不錯，就是振幅小，頻率高的那種。

  4、細胞要盡量打散，大部分呈單個狀態(tài)。離心后，要充分懸浮!還有轉(zhuǎn)移到六孔板后，是要晃得!晃的時候不要讓那個細胞液轉(zhuǎn)圈，不然細胞就全被帶到中間去了，就會不均勻!

  5、一瓶細胞長滿后，正常處理，在培養(yǎng)瓶里吹勻，然后鋪6孔板，每孔2毫升，鋪完之后不用觀察直接用酒精棉擦拭，然后放到培養(yǎng)箱里，輕微的左三圈 右三圈 前三圈 后三圈?；旧?4小時之后觀察 每孔的細胞都會很均勻。

  6、計算好所需要的全部液體量和細胞量，混勻后，加到六孔板里，六孔板按橫8字型晃，顯微鏡下觀察，如果不均勻，按上述方法再晃。如果細胞未計數(shù)直接種的話，在種六孔板的過程中，隨時晃一下混勻用的瓶子，瓶子我通常是順時針或逆時針轉(zhuǎn)圈。

  7、放在水平板面上先上下移動，再左右移動，每個方向5到6次，但關(guān)鍵的是搖完后直接放入培養(yǎng)箱中，不要再做過多的運動，例如放到鏡下去看，否則很容易就又聚到中間去了。

  上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務質(zhì)量"的方針。