甘油檢測(cè)試劑盒(組織，細(xì)胞)的原理

  描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200μmol/L

  原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化

  氫;在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

  適用范圍：測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。組成 (105 次微板測(cè)定或 30 次 1 ml 比色杯測(cè)定)：

  (1) 裂解液 50 ml

  (2) R1 試劑 16 ml

  (3) R2 試劑 4 ml

  (4) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml

  4 oC，儲(chǔ)存 3 月。

  所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或 721、722 型可

  見(jiàn)光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng) 550nm，如無(wú)此波

  長(zhǎng)建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。

  一 組織細(xì)胞裂解

  細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解： 消化、離心收集細(xì)胞?；蛑苯釉谂囵B(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x106個(gè)細(xì)胞，75cm2瓶約1x107細(xì)胞。按比例每 1~2 x 106細(xì)胞加 0.1ml 裂解液，混勻，靜置 10 分鐘。

  動(dòng)物組織裂解：

  切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織量(約 100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每 1mg 組織加10μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。(注意;裂解液用量在 1ml 或多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提取)。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。(不推薦超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量)，而后，靜置 10 分鐘。

  二. 裂解液處理：

  1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中，進(jìn)行步驟

  2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量或-20oC 儲(chǔ)存。

  2. 70oC 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

  3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定。

  三 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合即可，立即使用或 4oC 保存<1 天，變色棄去。(注意：謹(jǐn)防來(lái)源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來(lái)自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等。)

  四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液*的液體，將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μmol/L，通常取其中 4~6 管即可，注意設(shè)置 0 濃度對(duì)照反應(yīng)管。

  五 甘油測(cè)定

  1. 參見(jiàn)下表加樣。待測(cè)樣品體積 10μl，多加可能會(huì)抑制反應(yīng)。

  2. 37oC 或 25oC 反應(yīng) 10 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60 分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

  3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管 OD 值。

  4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

  附 Excel 作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R2 值-。

  5. 以每 mg 蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

  說(shuō)明：

  1.血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

  2.紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成磷酸甘油影響測(cè)定。

  參考文獻(xiàn)：

  1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

  2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

  甘油檢測(cè)試劑盒(組織，細(xì)胞)的原理

  甘油檢測(cè)試劑盒(組織，細(xì)胞) 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營(yíng)宗旨;牢固樹(shù)立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開(kāi)發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。