色譜法是生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域的重要分析手段，在藥物分析中有著為重要的地位。    色譜法是生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域的重要分析手段，在藥物分析中有著為重要的地位。
    色譜柱中固定不變的物質(zhì)是固定相，攜帶樣品向前流動(dòng)的是流動(dòng)相，色譜類型較多，從不同角度可以有不同的分類方法。
    色譜法分類
    1、按流動(dòng)相和固定相所處狀態(tài)分類：
流動(dòng)相為氣體的稱為氣相色譜，流動(dòng)相為液體的稱為液相色譜。固定相為固體的可分為氣固色譜(GSC)或液固色譜（LSC），固定相為液體的有氣液色譜（GLC）或液液色譜（LLC）。
    2、按固定相的形態(tài)分類：
    可分為柱色譜法、平面色譜法，如，紙色譜法、薄層色譜法等。
    3、按分離過程的機(jī)制分類：
    可分為分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法和空間排阻色譜法等類型，后兩者只存在于 液相色譜中。
    另外，還有其他分離機(jī)制的色譜方法，如，毛細(xì)管電泳法，根據(jù)組分的電泳速度差異而實(shí)現(xiàn)分離。
    色譜流出曲線與有關(guān)概念
    （一）色譜流出曲線和色譜峰：
    1、色譜流出曲線：在色譜分析中,樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器,所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線,稱為色譜流出曲線(elution profile),又稱色譜圖。
    2、基線：在操作條件下，沒有組分流出、僅有流動(dòng)相通過檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所形成的流出曲線。穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條平行于橫軸的直線。基線反映儀器（主要是檢測(cè)器）的噪聲隨時(shí)間的變化。
    3、色譜峰：流出曲線上的突起部分，正常的色譜峰為正態(tài)分布曲線，曲線有zui高點(diǎn)，以此點(diǎn)的橫坐標(biāo)為中心，曲線對(duì)稱的向兩側(cè)快速、單調(diào)下降。
    一種組分的色譜峰可用峰高或峰面積（用于定量）、峰位（用保留值表示，用于定性）及峰寬（用于衡量柱效）說明。
    色譜流出曲線（色譜圖）和區(qū)域?qū)挾?/span>
    （二）保留值：
    1、保留時(shí)間（retention time）:色譜圖橫軸上從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分的色譜峰頂點(diǎn)的時(shí)間間隔為該組分的保留時(shí)間。
    2、死時(shí)間：不被固定相保留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰大值時(shí)的時(shí)間間隔。
    3、調(diào)整保留時(shí)間：組分被固定相滯留的時(shí)間。
    4、保留體積：從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度大時(shí)，所需通過色譜柱的流動(dòng)相體積，單位為mL。
    5、死體積：不被固定相保留的組分通過色譜柱所消耗的流動(dòng)相的體積。
    6、調(diào)整保留體積：保留體積減去死體積。
    7、相對(duì)保留值：兩組分的調(diào)整保留值之比，也是色譜系統(tǒng)的選擇性指標(biāo)。
    （三）色譜峰高和峰面積：
    1、峰高（peak height, h）：色譜峰頂點(diǎn)至基線的距離。
    2、峰面積（peak area, A）：色譜曲線與基線間包圍的面積。
    （四）色譜峰區(qū)域?qū)挾龋?/span>
    1、標(biāo)準(zhǔn)差：正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點(diǎn)間距離之半。
    2、半峰寬：峰高一半處的峰寬。
    3、峰寬：通過色譜峰兩拐點(diǎn)作切線在基線上所截得的距離。
    （五）分離度：
    又稱分辨率或分辨度，它是色譜圖中相鄰兩峰分離程度的量度。
    現(xiàn)在，說一說氣相色譜
    特點(diǎn)：
    分離效能高
    靈敏度高
    樣品用量少
    分析速度快
    應(yīng)用范圍廣
    固定相：
    對(duì)固定相要求：
    ① 在操作溫度下應(yīng)呈液態(tài)，且蒸氣壓要很低，否則易造成固定液流失，使色譜柱壽命下降，檢測(cè)器本底增高。
    ② 對(duì)各組分應(yīng)有較高的選擇性，即各組分的分配系數(shù)有較大的差異，從而獲得良好的分離效果。
    ③ 對(duì)分析樣品中的各組分有良好的溶解能力。
    ④ 具有良好的穩(wěn)定性，即在高溫下不分解和不與載體發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
    ⑤ 對(duì)載體具有良好的潤(rùn)濕性，能在載體表面形成均勻的薄膜。
    固定液的分類：
    按固定液化學(xué)類型分類
    烴類、聚硅氧烷類、醇類、酯類
    氣相色譜儀的維護(hù)保養(yǎng)
    （1）嚴(yán)格說明書要求，進(jìn)行規(guī)范操作，這是正確使用和科學(xué)保養(yǎng)儀器的前提。
    （2）儀器應(yīng)該有良好的接地，使用穩(wěn)壓電源，避免外部電器的干擾。
    （3）使用高純載氣，純凈的氫氣和壓縮空氣，盡量不用氧氣代替空氣。
    （4）確保載氣、氫氣、空氣的流量和比例適當(dāng)、匹配，一般指導(dǎo)流速以次為載氣30mL/min，氫氣30mL/min，空氣300mL/min，針對(duì)不同的儀器特點(diǎn)，可在此基礎(chǔ)上，上下做適當(dāng)調(diào)整。
    （5）經(jīng)常進(jìn)行試漏檢查（包括進(jìn)樣墊），確保整個(gè)流路系統(tǒng)不漏氣。
    （6）氣源壓力過低，氣體流量不穩(wěn)，應(yīng)及時(shí)更換新鋼瓶，保持氣源壓力充足、穩(wěn)定。
    （7）新填充的色譜柱不能馬上使用還需要進(jìn)行老化處理，避免固定液流失，產(chǎn)生噪音。
    （8）注射器要經(jīng)常用溶劑（如丙酮）清洗。試驗(yàn)結(jié)束后，立即清洗干凈，以免被樣品中的高沸點(diǎn)物質(zhì)污染。
    （9）要盡量用磨口玻璃瓶作試劑容器。避免使用橡皮塞，因其可能造成樣品污染。如果使用橡皮塞，要包一層聚乙烯膜，以保護(hù)橡皮塞不被溶劑溶解。
    （10）避免超負(fù)荷進(jìn)樣（否則會(huì)造成多方面的不良后果）。對(duì)不經(jīng)稀釋直接進(jìn)樣的液態(tài)樣品進(jìn)樣體積可先試0.1uL（約100ug），然后再做適當(dāng)調(diào)整。
    （11）對(duì)于欠穩(wěn)定的農(nóng)藥、中間體，zui好用溶劑稀釋后再進(jìn)行分析，這樣可以減少樣品的分解。
    （12）密封墊分一般密封墊和耐高溫密封墊，汽化室溫度超過300℃時(shí)用耐高溫密封墊，耐高溫密封墊的一面有一層膜，使用時(shí)帶膜的面朝下。
    （13）保持檢測(cè)器的清潔、暢通。為此，檢測(cè)器溫度可設(shè)得高一些，并用乙醇、丙酮和專用金屬絲經(jīng)常清洗和疏通。
    （14）保持氣化室的惰性和清潔，防止樣品的吸附，分解。每周應(yīng)檢查一次玻璃襯管，如污染，清洗烘干后再使用。
    （15）要定期更換空氣泵，氫氣發(fā)生器的硅膠和活性碳。
    （16）操作過程中，一定要先通載氣再加熱，以防損壞檢測(cè)器。
    （17）在使用微量進(jìn)樣器取樣時(shí)要注意不可將進(jìn)樣器的針芯完全拔出，以防壞進(jìn)樣器。
    （18）進(jìn)樣口溫度一般應(yīng)高于柱溫30～50度。檢測(cè)器溫度不能低于進(jìn)樣口溫度，否則會(huì)污染檢測(cè)器進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫的zui高值，同時(shí)化合物在此溫度下不分解
    （19）含酸、堿、鹽、水、金屬離子的化合物不能分析，要經(jīng)過處理方可進(jìn)行。
    （20）進(jìn)樣器所取樣品要避免帶有氣泡以保證進(jìn)樣重現(xiàn)性。
    （21）取樣前用溶劑反復(fù)洗針，再用要分析的樣品至少洗2～5次。
    （22）儀器要定期空走程序升溫老化柱子，這樣會(huì)提高柱子的使用壽命和降低儀器污染。
    液相色譜的那些知識(shí)
    液相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)
    優(yōu)點(diǎn)：
    分離效率高，選擇性好，檢測(cè)靈敏度高，操作自動(dòng)化，應(yīng)用范圍廣；
與氣相色譜法相比具有的優(yōu)點(diǎn)：不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，應(yīng)用范圍廣；流動(dòng)相種類多，可通過流動(dòng)相的優(yōu)化達(dá)到高的分離效率；一般在啊室溫下分析即可，不需高柱溫。
    缺點(diǎn)：
    分析成本高，液相色譜儀價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用貴，分析時(shí)間一般比氣相長(zhǎng)。
    操作注意事項(xiàng)
    1、色譜柱的柱效和保護(hù)柱
    拿到一根新柱時(shí)，一定要先看其使用說明，然后測(cè)柱效，定期檢測(cè)柱效，保留在新色譜柱上得到的色譜圖，并記錄條件，定期檢測(cè)儀器的譜帶展寬，若應(yīng)用于在線監(jiān)測(cè)，應(yīng)對(duì)色譜柱提供在線的物理保護(hù)和化學(xué)保護(hù)，例如采取安裝在線過濾器，自裝填料保護(hù)柱和預(yù)裝保護(hù)柱等。在線過濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計(jì)，優(yōu)點(diǎn)是基本不影響柱效，在需要高柱效的時(shí)候常用，常更換的消耗品是濾芯和墊圈。
    保護(hù)柱的作用是防止柱子被化學(xué)污染，缺點(diǎn)是多數(shù)保護(hù)柱影響色譜柱的柱效，特別是在用微柱時(shí)，常用的是普通自裝填料的保護(hù)柱。zui近新出的一些保護(hù)柱例如Sentry-guard保護(hù)柱,它的特點(diǎn)是高質(zhì)量、填料、增加分析柱效、對(duì)臟樣品載荷能力大，能延長(zhǎng)保護(hù)柱的壽命，手可擰緊接頭，安裝時(shí)不需要工具，省時(shí)省，可換芯式設(shè)計(jì)，能采用各種不同的填料，主要適用于非常臟非常復(fù)雜的樣品本底，例如，生化樣品，環(huán)境樣品和食品等，或者不想做太多的固相萃取，不想降低柱效果等情況。
    2、色譜柱的清洗
    對(duì)所做的樣品要有充分的了解，用對(duì)該樣品洗脫能力zui強(qiáng)的流動(dòng)相清洗，對(duì)于硅膠柱，先用甲醇洗去性雜質(zhì)，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷100-200mL 依次活化，對(duì)于鍵和相柱，一般用甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗， 每種色譜柱有特定的清洗方法， 一定要看其使用說明。
    3、色譜柱的存放
    存放前除去雜質(zhì)和鹽，采用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的干枯，避免機(jī)械振動(dòng)，防止細(xì)菌生長(zhǎng)，注意存放的溫度。
    色譜柱的常見故障及排除
    1、柱壓過高
    可能是微粒堵塞，柱床膨脹，不可逆吸附，細(xì)菌生長(zhǎng)等造成的。也有可能是系統(tǒng)反壓?jiǎn)栴}，例如阻尼器堵塞，進(jìn)樣器堵塞，管路或連接口堵塞，在線過濾器不干凈，壓力傳感器不準(zhǔn)確等。
    2、柱效低
    可能是色譜柱被污染、過濾片部分堵塞、色譜柱內(nèi)的死體積造成，例如，流動(dòng)相pH值或者組成不合適造成固定相損失，流動(dòng)相急劇變化造成固定相物理?yè)p壞，機(jī)械振動(dòng)造成固定相產(chǎn)生裂縫，柱床收縮或干枯。也有可能是儀器連接的問題，認(rèn)真檢查進(jìn)樣器、檢測(cè)器、管路、保護(hù)柱和在線過濾器等是否連接好，也可能是色譜柱沒有平衡好，進(jìn)樣量過大等問題。
    3、重復(fù)性差、不出峰、回收率低
    可能是色譜柱被污染，流動(dòng)相pH 值或者組成不合適造成固定相損失，樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定，固定相性過強(qiáng)或者流動(dòng)相性過弱，或者發(fā)生非特異性吸附。也可能梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足，溫度波動(dòng)，流動(dòng)相組成改變，樣品溶劑不同，樣品穩(wěn)定性不好，方法的開發(fā)不好，緩沖液的酸堿度不合適或者緩沖能力不足。
    小結(jié)

    色譜法是先將混合物中各組分分離，而后逐個(gè)分析，因此，是分離分析復(fù)雜混合物有利手段，具有高靈敏度、高選擇性、能、速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

                                                                                       （本文內(nèi)容來源于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系我們刪除）