作為由微生物長(zhǎng)期進(jìn)化而形成的獲得性免疫系統(tǒng)，CRISPR-Cas能夠?qū)Ω鞣N方式的入侵產(chǎn)生特異的防御，比如質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化或結(jié)合、噬菌體的感染等。該防御過(guò)程包括3個(gè)階段：一是新間隔序列的獲取，稱適應(yīng)階段；第二是crRNA的合成，即CRISPR基因座的表達(dá)；第三是對(duì)外來(lái)核酸的抵御，稱干擾階段。上述提及的不同系統(tǒng)在這3個(gè)階段存在一定的差異。
CRISPR-Cas系統(tǒng)適應(yīng)階段
當(dāng)外源核酸入侵含有CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物體，宿主先對(duì)其進(jìn)行識(shí)別和掃描，之后通過(guò)相關(guān)蛋白將其捕獲并整合至先導(dǎo)序列下游，形成新的間隔序列。對(duì)于大多數(shù)的CRISPR系統(tǒng)，外源核酸的識(shí)別與選擇依賴于原間隔序列鄰近的2–5個(gè)核苷酸，稱PAM序列，它除了在整合階段發(fā)揮作用，還能夠指導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)外源核酸進(jìn)行特異切割，從而避免宿主發(fā)生自身免疫。
Ⅰ型系統(tǒng)在該階段通過(guò)兩種方式捕獲外源核酸。當(dāng)噬菌體次入侵生物體，宿主采用“naive”方式整合外源DNA，利用RecBCD、限制核酸酶或系統(tǒng)相關(guān)核酸酶將外源DNA處理成小片段，Cas1-Cas2復(fù)合物掃描PAM序列選擇合適片段，通過(guò)親核進(jìn)攻和非Cas蛋白修復(fù)系統(tǒng)將片段整合至基因座中。
若系統(tǒng)已整合間隔序列，噬菌體再次入侵則采用“primed”方式獲取外源DNA，該過(guò)程包含Cas3處理DNA和Cas1-Cas2復(fù)合物對(duì)合適片段整合等過(guò)程。Ⅱ型中Cas9-tracrRNA復(fù)合物同Cas1-Cas2復(fù)合物參與到對(duì)外源核酸整合過(guò)程，有研究表明Ⅱ-A亞型的Csn2和Ⅱ-B亞型的Cas4也參與其中。Ⅲ型中Cas1蛋白能與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，將RNA片段直接整合至系統(tǒng)中。
CRISPR基因座表達(dá)階段
CRISPR基因座表達(dá)的起始產(chǎn)物為長(zhǎng)達(dá)30–65 nt的pre-crRNA，經(jīng)過(guò)相關(guān)Cas蛋白和RNA核酸酶的加工形成成熟crRNA，此過(guò)程即為CRISPR基因座的表達(dá)。
一大類系統(tǒng)中，Cas6蛋白不依賴于金屬離子識(shí)別前體crRNA的重復(fù)區(qū)域并進(jìn)行切割，對(duì)前體crRNA進(jìn)行加工。Ⅰ-C亞型因缺乏Cas6，由Cas5d蛋白代替參與到該過(guò)程中，Ⅲ型往往也缺乏該類蛋白，通過(guò)利用孤立的類似Cas6核酸酶來(lái)負(fù)責(zé)加工過(guò)程，比如嗜熱細(xì)菌HB8。
第二大類中，Ⅱ型系統(tǒng)的tracrRNA先與前體crRNA部分序列互補(bǔ)配對(duì)形成復(fù)合物，Cas9蛋白穩(wěn)定復(fù)合物狀態(tài)，隨后內(nèi)源性RNA核酸酶對(duì)前體crRNA的重復(fù)序列區(qū)域剪切進(jìn)行加工；Cpf1及C2c2分別是Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)的重要蛋白，利用自身RNA核酸酶活性對(duì)前體crRNA進(jìn)行加工。
CRISPR-Cas系統(tǒng)干擾階段
干擾階段是防御入侵重要的一步，主要通過(guò)RNA介導(dǎo)準(zhǔn)確識(shí)別外源核酸并對(duì)其進(jìn)行剪切。一大類系統(tǒng)的多亞基效應(yīng)復(fù)合物和第二大類系統(tǒng)的單效應(yīng)蛋白在此階段發(fā)揮重要作用。
一大類系統(tǒng)中，Ⅰ型系統(tǒng)效應(yīng)復(fù)合物由Cas蛋白和成熟crRNA構(gòu)成。在該過(guò)程起始，效應(yīng)復(fù)合物中Cse1亞基識(shí)別靶標(biāo)DNA的PAM序列并與之結(jié)合，造成DNA從PAM端逐漸解開，進(jìn)一步crRNA與目標(biāo)DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物從而使效應(yīng)復(fù)合物構(gòu)象發(fā)生變化，招募Cas3蛋白對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行解旋并切割，后切割產(chǎn)物ssDNA作為底物被其他核酸酶徹底降解以達(dá)到防御目的。
同屬一類的Ⅲ型，Csm和Cmr系列蛋白為效應(yīng)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與Ⅰ型的有一定相似性，但作用機(jī)理存在差異，區(qū)別在于Ⅲ型系統(tǒng)依賴于crRNA或相關(guān)蛋白識(shí)別自身和外源核酸，非PAM序列。此外，上述提到Ⅲ型系統(tǒng)能夠干擾RNA是由Cmr效應(yīng)復(fù)合物負(fù)責(zé)，另一亞型系統(tǒng)Csm效應(yīng)復(fù)合物則靶向DNA，有研究表明Csm復(fù)合物能靶向DNA和RNA以及兩種亞型復(fù)合物是依賴于轉(zhuǎn)錄的DNA核酸酶。
第二大類中，Ⅱ型系統(tǒng)的Cas9蛋白與crRNA和tracrRNA形成效應(yīng)復(fù)合物對(duì)外源DNA進(jìn)行干擾，復(fù)合物中Cas9蛋白通過(guò)識(shí)別原間隔序列3′端PAM序列靶向DNA使其解旋，同時(shí)crRNA與之互補(bǔ)配對(duì)形成R環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后Cas9蛋白的核酸酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生變化并切割DNA。
Ⅴ型系統(tǒng)與Ⅱ型相似，Ⅴ-B亞型的C2c1蛋白在tracrRNA的協(xié)助下切割外源核酸，Ⅴ-A亞型的Cpf1蛋白作為效應(yīng)因子即可靶向外源DNA。此外，Ⅴ型系統(tǒng)通過(guò)識(shí)別位于5′端且富含胸腺嘧啶的PAM序列確定目標(biāo)DNA。在原間隔序列3′端具有特定序列條件下，Ⅵ型的效應(yīng)蛋白C2c2在crRNA的介導(dǎo)下靶向外源ssRNA并進(jìn)行切割。