細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。

具體操作：

一.準(zhǔn)備工作：    

    取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。

二.細(xì)胞懸液制備：

細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。

三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：

1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。

   2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。

   3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。

   4.統(tǒng)計(jì)四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。

   5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：

（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝          （  四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)         ×2×104 

說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。

公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。

公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個大格的體積為：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

   1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；

   2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

   3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計(jì)數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

   4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時，只按照一個細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。

   5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。

五.初學(xué)者易犯的錯誤：

   1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

   2. 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

   3. 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：

4％臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。

使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。