即用型藍白T載體A型(T7-SP6,有MCS)說明書

產(chǎn)品編號：BTN60603

規(guī)格：20T

產(chǎn)品及特點：

本產(chǎn)品是用Xcm I酶切環(huán)狀的可保種型藍白T載體(BTN60803)去掉一段1.3Kb的插入片段后得到的線性DNA片段(載體部分)，其兩個末端的5’都有一個突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐熱酶(如Taq DNA聚合酶)擴增得到的PCR片段。

1. 由于是通過Xcm I酶切制備，所以載體兩端的帶T率為，遠高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端轉移酶在平末端載體加尾得到的T載體。

2. 克隆的陽性率一般在90%以上, 縮短了篩選過程。

3. 插入位點兩側有對稱的常見酶切位點（如EcoR I），便于對克隆的PCR片段進行近一步的分析。

4. 克隆位點兩側分別有T7和T3 RNA聚合酶啟動子, 便于用克隆的PCR片段制備RNA探針。

5. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。

6. T克隆位點位于β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)內(nèi)，可以進行藍白斑篩選。

7. 含有絲狀噬菌體f1 復制起始子，可以制備單鏈DNA。

格及成分：

保存條件：

低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

自備試劑：

連接反應試劑，超純水。

使用方法：

一. PCR產(chǎn)物的純化和定量

1. 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離。zui好不要使用TBE緩沖液，因為它會影響DNA的膠回收效率。

2. 在長波(360nm)紫外燈下快速切膠，盡可能切掉多余的凝膠。為避免嘧啶二聚體的形成，可以使用百奧萊博的DNA防護劑UV Erasol（BTN60601）。

3. 用百奧萊博的柱式DNABACK（BTN60202）純化回收PCR片段。溶解PCR片段的超純水體積越小越便于后續(xù)操作。

4. 將回收的片段與濃度已知的DNA Marker在含EB（BTN3180）或綠如藍染料（BTN70303）的瓊脂糖凝膠中電泳，通過比較DNA條帶的熒光強度

而估測PCR純化產(chǎn)物的濃度。注意：一般不推薦使用測OD260的方法，因為回收的DNA很珍貴，該方法需要比較多的DNA。

5. 如果所得的DNA片段濃度較低，可以使用本公司核酸濃縮劑（BTN110801）將其濃縮到需要的濃度。

6. 如果PCR片段為平末端，則需要用加A試劑盒處理，否則不能用于與T載體的連接反應。

二. 連接反應

1. 短暫離心裝有T載體的離心管。

2. 在兩個離心管中加入下列成分：

注: PCR純化產(chǎn)物與藍白T載體的摩爾比zui好為3-10，可以按下面的公式計算出連接反應中需要的PCR 純化產(chǎn)物的ng數(shù):

假如插入片段和載體的連接比例設定為3，連接反應中加入藍白T載體(長度為3 Kb)的量為40ng，則需要長度為0.5 Kb 的PCR 純化產(chǎn)物的量是:

3. 用移液器吹打連接反應使之混勻后，16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的說明書進行連接)。

三. 細菌轉化

1. 將100 μL感受態(tài)細胞于冰上解凍。注意：zui好使用轉化效率在1×10⁸cfu/μg DNA以上的感受態(tài)細胞進行轉化，因為采用單堿基突出端進行連接不是很有效。

2. 取5 μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內(nèi)容物。在冰上放置30分鐘。

3. 將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱休克90秒?？焖賹⒐苻D移到冰浴中。