2015年值得關(guān)注的五大技術(shù)
發(fā)布日期：2015-01-10 瀏覽次數(shù) ：603
【導(dǎo)讀】激光層照熒光顯微技術(shù)能以很高的3D分辨率，長時間對生物學(xué)樣本進(jìn)行溫和成像。這一技術(shù)結(jié)合高速相機(jī)，足以捕捉細(xì)胞或亞細(xì)胞水平發(fā)生的動態(tài)。
日前，《Nature Methods》雜志將這個低光毒性的快速三維成像技術(shù)評為了2014年的年度技術(shù)。
激光層照熒光顯微技術(shù)的基本原理很簡單，它不像寬場或共聚焦顯微鏡那樣照射或掃描整個樣本，而是用薄層光從側(cè)邊照射樣本，然后從樣本的上部或下部檢測熒光，激發(fā)光路與檢測光路垂直。激光層照熒光顯微鏡激發(fā)一個層面上的熒光基團(tuán)，一次成像一個面，這種技術(shù)不僅大大降低了光毒性，還提高了長時間成像活樣本的能力。
Light-sheet技術(shù)始于一百年前，原本是用來成像膠體的。后來，Ernst Stelzer等人用這一技術(shù)成像了熒光標(biāo)記的活斑馬魚胚胎，Light-sheet技術(shù)由此重新煥發(fā)了活力。Stelzer在本期Nature Methods雜志上撰文，介紹了這一技術(shù)的起源、原理和應(yīng)用潛力。
激光層照熒光顯微技術(shù)的崛起，離不開熒光蛋白和轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的發(fā)展。實際上，只有物理學(xué)、生物學(xué)等多個領(lǐng)域進(jìn)行跨學(xué)科合作，人們才能充分挖掘出這一技術(shù)的潛力。隨著商業(yè)化儀器的不斷推出和升級，相信激光層照技術(shù)將為我們揭示以往難以想象的生物學(xué)細(xì)節(jié)。
2015值得關(guān)注的技術(shù)之二：DIA質(zhì)譜
傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)采用數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）策略，將蛋白質(zhì)樣品消化成肽段，離子化并通過質(zhì)譜進(jìn)行分析。在全掃描質(zhì)譜圖中，高于噪音的肽段信號被選擇性裂解，產(chǎn)生隨機(jī)（MS/MS）質(zhì)譜，能夠與數(shù)據(jù)庫中的圖譜相匹配。盡管這種方法非常強(qiáng)大，但它隨機(jī)抽取肽段進(jìn)行裂解，總是偏向于那些信號強(qiáng)的峰。因此，低豐度肽段的定量仍是挑戰(zhàn)。
早在兩年前，《Nature Methods》就將年度技術(shù)頒給了靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。在成熟的定向分析技術(shù)——選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）中，質(zhì)譜儀能非常靈敏地檢測到特定肽段，具有高的定量準(zhǔn)確性。然而，這種方法并不適合于發(fā)現(xiàn)型的應(yīng)用。
因此，蛋白質(zhì)組研究界如今將目光集中在數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）上，它在理論上綜合了DDA和SRM的。在DIA分析中，質(zhì)荷比（m/z）窗口內(nèi)的所有肽段都經(jīng)過裂解；分析重復(fù)，直至質(zhì)譜儀覆蓋整個m/z范圍。這實現(xiàn)了準(zhǔn)確的肽段定量，而不限于分析預(yù)先定義的肽段。
盡管DIA的概念早在十年前就被引入，但直到近開發(fā)出一些實際的DIA應(yīng)用，它才重新點燃了人們的興趣。蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的許多科學(xué)家都看到了DIA的潛力，認(rèn)為它有望解決DDA所面臨的問題，但其他人并沒有留下深刻的印象?！禢ature Methods》的編輯AllisonDoerr認(rèn)為，也許DIA還需要進(jìn)一步應(yīng)用到更具挑戰(zhàn)性的生物問題，才能展示它的。
2015值得關(guān)注的技術(shù)之三：深度成像
要了解器官或組織的結(jié)構(gòu)和功能，是在其完整狀態(tài)下進(jìn)行研究。正因如此，透視器官深處一直是生物學(xué)家的一大夢想，現(xiàn)在能實現(xiàn)這一夢想的技術(shù)已經(jīng)觸手可及。
一般來說，要對不透明的生物樣本進(jìn)行深度成像是非常困難的。為了克服這個問題，人們開發(fā)了許多“透明化”方法。CUBIC、iDISCO和PACT都能使固定樣本的組織透明化，并且保留熒光標(biāo)記的信號。這樣的技術(shù)將會滲透到多個領(lǐng)域，為人們解決各種各樣的問題。（延伸閱讀：Cell：透明小鼠實現(xiàn)系統(tǒng)生物學(xué)終夢想）
不過，上述透明化技術(shù)并不適合活體樣本。在這種情況下，我們需要通過其他途徑來減少樣本的光散射和提高透明度。舉例來說，我們可以使用非線性激發(fā)（比如雙光子顯微鏡）或者近紅外光成像，近紅外光在生物組織上有較深的穿透能力。近人們還開發(fā)了遺傳學(xué)編碼的近紅外探針和納米顆粒，特別適合非侵入性的癌癥研究和活細(xì)胞追蹤。更長波長的成像技術(shù)，將實現(xiàn)更深的組織穿透。
2015值得關(guān)注的技術(shù)之四：微小晶體的結(jié)構(gòu)
大家都知道，通過X射線衍射確定原子結(jié)構(gòu)時，先你得有大的、結(jié)構(gòu)良好的蛋白質(zhì)晶體。這說來容易做來難。許多蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白，無法形成大的晶體，往往形成納米或微米大小的晶體。在幾年前，這種微小的晶體基本上被認(rèn)為是沒用的，因為在衍射數(shù)據(jù)記錄之前它們就會受損。不過，新的技術(shù)如今也能從這些晶體上獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。
一種方法是飛秒X射線晶體學(xué)，其中微小的晶體涌入飛秒脈沖的路徑，這些脈沖來自其明亮的X射線自由電子激光裝置（XFEL）。X射線的脈沖非?？?，因此在晶體被破壞之前就能收集衍射圖像。自2011年引入這項技術(shù)之后，它經(jīng)過快速發(fā)展，并不斷擴(kuò)大應(yīng)用范圍。
2014年，這項技術(shù)帶來了新的結(jié)構(gòu)和見解，并不斷改進(jìn)將微小晶體引入XFEL光路以及數(shù)據(jù)分析的方法。去年，地區(qū)擁有XFEL的研究機(jī)構(gòu)——日本理化學(xué)研究所發(fā)表了一些生物學(xué)成果。而在未來幾年，德國和瑞士XFEL設(shè)施的建設(shè)也有望完成。
2015值得關(guān)注的技術(shù)之五：新一代CRISPRs
當(dāng)人們提到所謂的使能技術(shù)），類似印刷機(jī)的發(fā)明，或者麻醉藥的發(fā)現(xiàn)就會浮現(xiàn)在我們腦海中。而對于科學(xué)家來說，CRISPR-Cas9系統(tǒng)就是這樣一種系統(tǒng)。
這種細(xì)菌免疫系統(tǒng)能通過將病毒DNA中的短重復(fù)片段整合到細(xì)菌基因組中，來抵抗病毒。當(dāng)細(xì)菌（或其后代）第二次感染病毒的時候，這些重復(fù)序列就能通過一種核酸酶靶向侵入的互補(bǔ)DNA，并摧毀它。
2013年幾個研究組就利用了這一系統(tǒng)編輯真核生物基因，隨后看到在不少應(yīng)用中CRISPRs迅速崛起，多個不同物種都實現(xiàn)了基因組中基因刪除和插入，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。但是隨著這一系統(tǒng)越來越受歡迎，關(guān)于其特異性和有效性的質(zhì)疑也越來越多。
如何提高導(dǎo)向RNA（gRNA）的特異性是一大問題，這種RNA能將Cas9核酸酶帶領(lǐng)到基因組目標(biāo)位置，Nature Biotechnology雜志建議切斷gRNAs（Nature子刊：巧解基因編輯脫靶問題），減少脫靶問題，而且不影響靶標(biāo)活性，而另外一個研究組則建議更長一些的gRNAs。
這明顯是有些自相矛盾的建議，前者的研究人員指出只是簡單截短了gRNA靶標(biāo)區(qū)域的長度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在之前檢測到的脫靶位點，脫靶突變都大幅減少，與全長gRNA相比，一些位點的突變頻率甚至減少了5，000倍以上。重要的是在靶向它們的預(yù)定目標(biāo)DNA時，這些縮短了的gRNA（稱為tru-gRNA）與全長gRNA同樣有效。而后者則發(fā)現(xiàn)選擇合適的靶標(biāo)序列，優(yōu)化gRNA和Cas9，就能避免或者減少脫靶突變的出現(xiàn)。另外一個問題是如何篩選脫靶，以及中對于研究的影響有多少?？梢则炞CgRNAs錯配候選位點的方法也許會錯失一些關(guān)鍵的剪切位點，而且全基因組測序也不是非常有效，目前我們需要一種敏感且無偏差的方法，來標(biāo)記Cas9靶標(biāo)位點，并令它們能在整個基因組中被識別出來。
其它的令這一系統(tǒng)特異性更強(qiáng)的方法還有，用配對替換切口酶（nickases）替換Cas9核酸酶（前者每次只能切斷DNA一條鏈），或者將Cas9突變?nèi)诤系紽ok1這種需要催化激活的核酸酶中去。此外，通過來自不同物種的Cas9也能增加靶向多個位點的靈活性，進(jìn)一步改善Cas9-gRNA復(fù)合物的傳遞系統(tǒng)，也有助于增加效率。
盡管Cas9潛力，但是這還是一種細(xì)菌的蛋白，對于一些應(yīng)用，尤其是臨床上的應(yīng)用來說，還需要尋找真核生物核酸酶進(jìn)行替換。對于植物來說，一些Argonaute核酸酶能通過小RNAs靶向DNA，這也是基因組編輯可以考慮的一個方向。
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