在激發(fā)波長(zhǎng)500nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 附近，使用熒光顯微鏡/激光共聚焦檢測(cè)綠色熒光，從而測(cè)定組織內(nèi)活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測(cè)樣本內(nèi)活性氧水平變化差異。

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冰凍切片活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR7814

產(chǎn)品組成：

保存條件：

DCFHDA探針-20℃避光保存；清洗液2-8℃保存。有效期6個(gè)月。

【注】：

● 探針開(kāi)蓋前4℃/-20℃避光保存。長(zhǎng)期不用可以-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

● 熒光探針為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁，注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時(shí)間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否則容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

冰凍切片活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括過(guò)氧化氫（H₂O₂，Hydrogen peroxide）、羥基自由基（?OH，Hydroxyl radical）、單線態(tài)氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧陰離子(?O2-，Superoxide anion)、過(guò)氧化自由基(ROO? ，Peroxyl radical)、過(guò)氧羥自由基（HOO? ，hydroperoxyl）及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物過(guò)氧亞硝基陰離子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生主要是氧化磷酸化的結(jié)果，在呼吸鏈中，在某些位點(diǎn)會(huì)有“泄露”的電子直接和氧氣或和其他電子受體反應(yīng)，在酶或非酶作用下引發(fā)一系列反應(yīng)生成不同種類(lèi)的活性氧：“泄露”的電子最初和氧氣反應(yīng)生成超氧陰離子自由基(O2·-)。超氧陰離子遇水生成H2O2，同時(shí)過(guò)氧化氫也可由氧氣在單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成，生成的過(guò)氧化氫在髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下與Cl-反應(yīng)可生成ClO-，在鐵或銅離子的催化下發(fā)生Fenton反應(yīng)生成OH·，超氧陰離子遇氮氧化物反應(yīng)生成ONOO-。這些生成的高氧化活性的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為活性氧。

冰凍切片活性氧檢測(cè)試劑盒是一種利用熒光探針DCFHDA進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。DCFHDA本身沒(méi)有熒光，被活性氧特異性氧化生成綠色熒光物質(zhì)，綠色熒光強(qiáng)度與活性氧水平成正比，檢測(cè)綠色熒光就可以知道組織內(nèi)活性氧的水平。

在激發(fā)波長(zhǎng)500nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 附近，使用熒光顯微鏡/激光共聚焦檢測(cè)綠色熒光，從而測(cè)定組織內(nèi)活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測(cè)樣本內(nèi)活性氧水平變化差異。

切片樣本的活性氧檢測(cè)一般最好使用振動(dòng)切片或者新鮮的冰凍切片樣本。石蠟切片樣本的ROS在切片的的制作過(guò)程中會(huì)損失掉，有條件的話就使用振動(dòng)切片或者冰凍切片樣本，一般不建議使用石蠟切片樣本。有條件的話也可以采用直接用組織樣本檢測(cè)，使用不需要制備成切片的ROS檢測(cè)試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便：可用熒光顯微鏡直接觀察；

● 背景低，靈敏度高；

● 線性范圍寬，使用方便。

檢測(cè)方法：

● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦顯微鏡

樣本類(lèi)型：

● 新鮮冰凍切片 ● 振動(dòng)切片

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● 移液器 ● PBS

冰凍切片活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 盡量縮短探針標(biāo)記后到測(cè)定所用的時(shí)間，以減少各種可能的誤差。

● 對(duì)于某些樣本，如果熒光太強(qiáng)，可以按照1:200-1:1000稀釋探針。探針標(biāo)記的時(shí)間也可以根據(jù)情況在20-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

● 以下操作步驟僅供參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際樣本情況調(diào)整。

使用方法：

一、試劑配制

1、根據(jù)樣本數(shù)，用純水將DCFHDA活性氧熒光探針200-1000倍稀釋?zhuān)涑扇旧ぷ饕骸?

【注】：

● 不同樣本的活性氧差異較大，需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整稀釋倍數(shù)。一般染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋?zhuān)畲罂芍?0000倍稀釋?zhuān)?000倍稀釋適合大多數(shù)樣本。

2、用純水將10×清洗液10倍稀釋?zhuān)涑?×清洗液工作液。

二、探針標(biāo)記

1、準(zhǔn)備待測(cè)的厚為10-20μm的未經(jīng)固定處理的冰凍切片。

【注】：

● 必須使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時(shí)內(nèi)）制成的冰凍切片/振動(dòng)切片。

● 否則不新鮮的樣本可能ROS已經(jīng)流失，檢測(cè)不到活性氧。

● 非新鮮樣本殘余的ROS也可以檢測(cè)到。

2、室溫下，小心加上200μL清洗液工作液，鋪滿(mǎn)整個(gè)切片表面，靜置5-10分鐘。

3、小心吸除清洗液。

4、滴加100μL染色工作液，在37℃培養(yǎng)箱避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 最好在濕盒中孵育，避免液體蒸發(fā)。

5、移除染色液。

6、用PBS洗滌切片2-3次。

7、加蓋玻片或甘油封片。

8、熒光顯微鏡檢測(cè)。

【注】：

● 染色完成后，立即進(jìn)行熒光定性分析。

● 激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm。

● 熒光強(qiáng)，表明活性氧（ROS）含量高。

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