凍存樣本核蛋白提取試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、酶活性測定等蛋白研究。本試劑盒不含有EDTA，與金屬螯合層析等下游應(yīng)用兼容。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

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凍存樣本核蛋白提取試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR0129

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

蛋白提取液2-8℃保存；蛋白酶抑制劑-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃保存，開蓋使用后-20℃保存。

● 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài),從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴,變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。 

產(chǎn)品簡介：

凍存樣本核蛋白提取試劑盒適用于從各種原代或傳代細(xì)胞和各種動物實(shí)體組織，如腦、脊髓、神經(jīng)結(jié)或纖維、脂肪、肝臟、消化道、腎臟、心臟、肌肉、血管、結(jié)締組織等動物組織中提取核蛋白和胞漿蛋白。提取過程簡單方便，可在1小時內(nèi)完成。制備的核蛋白和胞漿蛋白不僅純度高，保持天然活性，且較少交叉污染。

本試劑盒含有的獨(dú)特配方能夠有效溶解細(xì)胞核膜組分。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀、酶活性測定等蛋白研究。

本試劑盒不含有EDTA，與金屬螯合層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒提取的蛋白含高濃度鹽，不可直接用于2D電泳，需要透析、除鹽后再用于2D電泳。如下游實(shí)驗(yàn)需直接用于2D電泳，請用其他貨號產(chǎn)品。也可將最后樣品除鹽后再用于2D電泳，用脫鹽柱脫鹽處理。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便，從細(xì)胞組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

● 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

● 蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

適用樣本：

● 組織 ● 細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器：

● 移液器 ● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 渦旋混勻器 ● PBS ● 蛋白定量試劑盒

注意事項：

● 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 如試劑盒不能短時間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

● Western實(shí)驗(yàn)內(nèi)參可以選用Lamin A、Lamin B、TBP、Histon H3.

凍存樣本核蛋白提取試劑盒使用方法：

1、提取液制備：

每200μL冷蛋白提取液B中加2μL蛋白酶抑制劑混合物，充分混勻后置冰上備用。

【注】：

● 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液，磷酸酶抑制劑可以一次加入。

● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未用完，再次用前需再次加入蛋白酶抑制劑。

● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

2、樣本解凍后，取適量組織樣本用手術(shù)剪刀盡可能剪碎，加冷PBS，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。

【注】：

● 細(xì)胞樣本直接按下面的第四步驟開始操作。

3、勻漿液在4℃，1000×g條件下離心3分鐘，棄上清，收集沉淀。

4、每20-40μL細(xì)胞沉淀體積中加入200μL冷的提取液A，告訴渦旋振蕩15秒或吹打混勻，置2-8℃條件振蕩20-30分鐘。

【注】：

● 提取液A處理后細(xì)胞體積應(yīng)減少，否則延長提取液A振蕩處理時間。

● 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速,提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可不振蕩,稍微延長提取液的的處理時間,中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

● 或者按每20-50mg組織重量加200μL試劑A。

5、在4℃，2000×g力條件下離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

6、在沉淀中加入80-200μL冷的蛋白提取液B，高速渦旋振蕩15秒。

【注】：

● 提取液B用量根據(jù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量情況調(diào)整，細(xì)胞數(shù)量多則多加，也可根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)時最終蛋白濃度試劑情況調(diào)整。

● 加提取液B前，必須盡可能吸干提取液A，否則會影響核蛋白純度。

● 對核蛋白純度要求較高時，也可以用PBS將沉淀洗滌一次。PBS重懸沉淀，2000×g離心5分鐘后收集沉淀再加提取液B。

7、置2-8℃條件振蕩30-40分鐘。

● 使用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速,提取液能輕微晃動即可。

● 沒有振蕩條件也可不振蕩,稍微延長提取液的的處理時間,中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。

● 此步驟蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時會出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的蛋白復(fù)合物。不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)即可；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，不必進(jìn)行超聲處理。如引入其他外源性蛋白質(zhì)不影響下游實(shí)驗(yàn)的話，也可以加入DNase處理。

8、在4℃，12000×g條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。

9、將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。

10、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

常見問題分析：

● 核蛋白濃度低？

核蛋白豐度較低，需要足夠細(xì)胞數(shù)量提取，在條件允許情況下，盡可能加大細(xì)胞量。

注意用蛋白提取液B處理時沒有裂解完全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長試劑B的處理時間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻，至無明顯沉淀。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

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