IP組織細(xì)胞蛋白裂解液是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞和組織的裂解液。能裂解細(xì)胞并充分釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。裂解蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能。

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IP細(xì)胞裂解液

 

產(chǎn)品編號(hào)：HR0265

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

裂解液2-8℃保存；蛋白酶抑制劑-20℃保存，有效期1年。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

IP組織細(xì)胞蛋白裂解液是一種在非變性條件下裂解細(xì)胞和組織的裂解液。能裂解細(xì)胞并充分釋放胞漿蛋白和可溶性膜蛋白、核蛋白。裂解蛋白產(chǎn)物最大限度地保留了蛋白的特性和功能。

本裂解液裂解的細(xì)胞和組織樣本，主要用于免疫沉淀和免疫共沉淀等。

本裂解液不含有離子型去垢劑組分，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白之間原有的相互作用的破壞，提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白，下游應(yīng)用范圍廣，提取液裂解細(xì)胞的能力較溫和，需要根據(jù)實(shí)際樣本情況優(yōu)化裂解時(shí)間。

IP細(xì)胞裂解液適用樣本：

● 細(xì)胞 ● 組織

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便，從細(xì)胞，組織提取蛋白不需經(jīng)過(guò)研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

● 提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便，將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí)。

● 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

● 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

● 總蛋白提取液含多種有效成分，可充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

● 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

 

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 離心機(jī) ● 振蕩器 ● 勻漿機(jī)/勻漿器 ● 渦旋混勻器 ● PBS緩沖液

● 蛋白定量試劑盒

注意事項(xiàng)：

● 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。

● 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

● 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

● 如果試劑盒不能短時(shí)間內(nèi)用完，蛋白酶抑混合物不可以一次加入提取液。

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

使用方法：

A、細(xì)胞裂解

1、裂解液制備：

每1mL冷的IP蛋白裂解液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測(cè)定某些細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、磷酸酶活性等下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

2、取5-10×10⁶個(gè)細(xì)胞，在4℃，1000×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

● 細(xì)胞可以收集后裂解，也可以直接原位裂解，根據(jù)操作習(xí)慣選擇。

3、用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

4、每5×10⁶個(gè)細(xì)胞中加入500μL冷的裂解液，混勻后，在4℃條件下振蕩15-20分鐘。

【注】：

● 每10⁶個(gè)細(xì)胞，大約10mg或10μL沉淀，加入100μL裂解液。大約相當(dāng)于6孔板的每孔加入100μL-150μL，或1個(gè)75cm²培養(yǎng)瓶加1mL。裂解液和細(xì)胞應(yīng)充分接觸。如果裂解液不足量，細(xì)胞裂解效率將會(huì)降低。

5、在4℃，12000-14000×g條件下離心15分鐘。

6、快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實(shí)驗(yàn)。

B、組織裂解

1、裂解液制備：

每1mL冷的IP蛋白裂解液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

【注】：

● 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑。

● 蛋白樣品用于測(cè)定某些細(xì)胞內(nèi)蛋白酶、磷酸酶活性等下游實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整抑制劑混合物是否加入。

2、取100mg組織樣本用手術(shù)剪刀剪碎，加入1mL裂解液，用組織勻漿器勻漿至無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)固體。

【注】：

● 如果組織樣品很細(xì)小，可剪碎后直接加入提取液振蕩15分鐘，可以不用勻漿器。

● 一般按組織：提取液用量1:10（w/v）左右加入提取液即可。如果需要提高得到的蛋白樣品濃度，可以將組織：提取液用量比例調(diào)整為1:5.

● 也可用液氮研磨的方法。

3、將組織勻漿液在4℃振蕩15-25分鐘。

4、在4℃，12000-14000×g條件下離心15分鐘。

5、快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，用于下游實(shí)驗(yàn)。

上述蛋白提取物可分裝后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?

【注】：

● 建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。

● 蛋白蛋白樣品-80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

IP細(xì)胞裂解液常見(jiàn)問(wèn)題分析：

● 蛋白濃度低？

處理部分組織樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解完全,導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑A的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理,沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

● 細(xì)胞裂解速度慢？

為了充分保證提取得到的蛋白的活性，提取液采用獨(dú)特的保護(hù)蛋白的配方，裂解能力溫和，下游應(yīng)用范圍廣。適當(dāng)延長(zhǎng)裂解的時(shí)間即可。

● 用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

● 提取時(shí)出現(xiàn)膠狀沉淀？

蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量透明膠狀物,屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下,可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過(guò)超聲處理,300w/10秒間隔10秒,超聲3分鐘,隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,例如NF-kappaB、p53等時(shí),不必進(jìn)行超聲處理。

● 提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

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